选择高度保守,无复杂二级结构的模板序列。 引物长度通常为18-24 bp(或者是17-25 bp),Tm值通常为58-62℃(可以偏高一点),上下游引物Tm不能超过2℃,长度差不超过4bp,引物GC含量在40-60%之间。 引物设计跨两个外显子。 产物大小在100-200 bp,最长不得超过300bp。

引物与模板上的序列要紧密互补,人物与人物之间避免形成稳定的二聚体或发甲夹结构