负染色法需要使用酸性染料来染色，如伊红或苯胺黑。

因为细菌体表面带负电，而酸性染料的色原也带负电，所以色原只能将背景染色，才能使没有染色的细胞很容易的被观察到。一些染色剂，如四氧化锇和铁氰化锇，化学活性非常强。作为强氧化剂，它们主要与交键类脂和不饱和碳碳键反应，从而改变样本组织的生物膜特性并将其染色。